熒光分光光度計(jì)測(cè)試注意事項(xiàng)

①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。

②在熒光分析時(shí)，為了得到穩(wěn)定且可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開(kāi)機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)、低人射光強(qiáng)度及短時(shí)間光照。

③溫度變化可引起熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量的子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測(cè)試溫度變化不超過(guò)±3℃，對(duì)測(cè)試結(jié)果幾乎無(wú)影響。

④當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì)發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。

⑤分子結(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強(qiáng)。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強(qiáng)度。

⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應(yīng)注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當(dāng)做熒光光譜。瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，拉曼散射與激發(fā)光波長(zhǎng)不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，因此可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)將拉曼散射光與熒光分開(kāi)。在測(cè)試時(shí)選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對(duì)散射光的影響進(jìn)行校正。

⑦熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見(jiàn)的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。

⑧測(cè)試過(guò)程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防眼睛造成損傷。

⑨儀器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng)，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。

熒光分析

熒光分析就是基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表征技術(shù)來(lái)研究體系的物理、化學(xué)性質(zhì)及其變化情況，例如生物大分子構(gòu)象及性質(zhì)的研究。

熒光光譜適用于固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據(jù)樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。

熒光光譜分析可與顯微鏡耦合，獲得微區(qū)分析結(jié)果。熒光是無(wú)損傷、非接觸的分析技術(shù)，還可用于自動(dòng)檢驗(yàn)、批量篩分、遠(yuǎn)程原位分析和分析。

熒光分析的優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高；（2）選擇性強(qiáng)；（3）試樣量少、方法簡(jiǎn)單；（4）提供較多的物理參數(shù)。但是也存在應(yīng)用范圍不夠廣泛、對(duì)環(huán)境敏感（干擾因素多）等缺點(diǎn)。

熒光光譜定量分析

在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強(qiáng)度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。

上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，熒光物質(zhì)濃度過(guò)高，其熒光強(qiáng)度反而降低。原因有：

（1）內(nèi)濾效應(yīng)。一是，當(dāng)溶液濃度過(guò)高時(shí)，溶液中雜質(zhì)對(duì)入射光的吸收作用增大，相當(dāng)于降低了激發(fā)光的強(qiáng)度。二是，濃度過(guò)高時(shí)，入射光被液池前部的熒光物質(zhì)強(qiáng)烈吸收，處于液池中、后部的熒光物質(zhì)，則因受到入射光大大減弱而使熒光強(qiáng)度大大降低；而儀器的探測(cè)窗口通常對(duì)準(zhǔn)液池中部，從而導(dǎo)致檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度大大降低。

（2）相互作用。較高濃度溶液中，可發(fā)生溶質(zhì)間的相互作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與其基態(tài)分子的二聚物或其他溶質(zhì)分子的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光光譜的改變和/或熒光強(qiáng)度下降。當(dāng)濃度更大時(shí)，甚至?xí)纬蔁晒馕镔|(zhì)的基態(tài)分子聚集體，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度更嚴(yán)重下降。

（3）自淬滅。熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與其吸收光譜呈現(xiàn)重疊，便可能發(fā)生所發(fā)射的熒光被部分再吸收的現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。溶液濃度增大時(shí)會(huì)促使再吸收現(xiàn)象加劇。

當(dāng)然，熒光強(qiáng)度的影響因素還有溶劑、溫度、pH值、散射光等，在定量分析中需要加以考慮。

熒光光譜定量分析的計(jì)算與其他光譜類(lèi)似，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比例法等。