甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)jia基化和非jia基化序列的引物進(jìn)行PCR。-個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn),但是我們一-旦掌握了這個(gè)區(qū)域的單體型,就可以只使用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs(tagSNP)來進(jìn)行基因分型,獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在jia基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在jia基化。

特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化。

亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個(gè) CpG 位點(diǎn)的jia基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。加2倍體積異，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul吸頭挑出，涼干，用200ulTE重新溶解。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克long至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測序法。

特點(diǎn)：jing確度高，能夠準(zhǔn)確檢測出jia基化的程度百分比。

逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建及包裝  

      逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程形成病毒顆粒。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、輔助載體（表達(dá)病毒包裝需要的蛋白質(zhì)）和包裝細(xì)胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源基因表達(dá)、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染范圍廣，可以各種細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)入的外源基因可完全融合，對(duì)細(xì)胞率高，細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。

     逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共有兩部分組成：包裝細(xì)胞系和缺陷病毒本身。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號(hào)，通過分子技術(shù)將目的基因插入此載體上，而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白。大部分線粒體基因由于其母系遺傳特性以及進(jìn)化速率較快等特點(diǎn)，被廣泛地用于種群遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、譜系地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、疾病診斷等學(xué)科領(lǐng)域。當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？善渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。

腺相關(guān)病毒包裝原理

腺相關(guān)病毒( adeno-associated virus, AAV)是一類細(xì)小病毒, 基銦組為單鏈DNA ,對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有g(shù)an染能力。通常需要腺病毒或皰zhen病毒幫助其在體內(nèi)fu制擴(kuò)增。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。重組腺相關(guān)病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因組與不同xue清型的衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體,可將目的基因的CDS區(qū)序列或者RNAi干擾序列插入rAAV表達(dá)質(zhì)粒中,包裝病毒后gan染細(xì)胞完成對(duì)目的基因的操作。腺相關(guān)病毒具有g(shù)an染溫和,免yi原性小,長效穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn),主要應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)注射。源井生物提供的腺相關(guān)病毒顆粒經(jīng)過超su離心純化,并通過qPCR對(duì)病毒基因拷貝進(jìn)行滴定。腺相關(guān)病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以滿足各類整體實(shí)驗(yàn)的使用要求。

15.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會(huì)發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯(cuò)的機(jī)會(huì)不多。5、滴度檢測:細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入病毒上清液，檢測陽性細(xì)胞比例。核酸合成公司一般會(huì)有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法解決這個(gè)問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)單體。隨著對(duì)lncRNA在哺乳動(dòng)物進(jìn)化及人類疾病發(fā)生和發(fā)展中作用的日益關(guān)注，lncRNA調(diào)控機(jī)制已成為當(dāng)前遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞轉(zhuǎn)化到大腸中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫呤），2,6 diaminopurine , DNA和擴(kuò)增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫呤現(xiàn)象在富含呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)模化生產(chǎn)中。