陽性對照和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質上樣量

注意：體內細胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負載將激l活Arf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細胞提取物等分到兩個微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個試管中（陽性對照）。

4，在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

當前沒有直接測定法來測量Arl1 GTPases的激l活。

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體，該抗l體特異性識別Arl1-GTP，但不能識別Arl1-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對其抗原的高度親和力，可以在短時間內進行激l活測定。 該測定法可提供可靠的結果，并具有一致的可重復性。

電泳和轉膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應和檢測（所有步驟都是在室溫下進行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識別Cdc42活性構象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如ECL顯色法。

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國生命科學試劑供應商美國NewEastBio在中國的子公司。公司位于武漢東湖高新技術開發(fā)區(qū)光谷生物城.美國NewEastBio專注于生命科學和生物技術領域，主要產品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長期穩(wěn)定的合作關系，產品銷往全球。

在G蛋白的四個亞家族中，G12/13亞家族的功能尚不清楚。在這個家族，有兩個成員，G12和G13，它們普遍表達。Gα12基因敲除小鼠看上去很正常。Gα13基因敲除小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性（~E9.5）。Gα13-/-老鼠胚胎的血管系統(tǒng)有缺陷。G13對受體酪氨酸激酶的誘導也是必不可少的成纖維細胞和內皮細胞的遷移。