Elisa試劑盒的安全性

8. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

2. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

3. 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

4. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

5. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

Elisa試劑盒——Elisa實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方案

顯色淡，靈敏度偏低

1  試劑盒未充分平衡 試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）

2  樣品不適合做ELISA檢測 樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件（例如稀釋液的成分）

3  酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時過分干燥 防止板過于干燥

4  包被遭到破壞 操作溫和，移液槍不能碰到孔底

5  樣本和孵育條件不合適 按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

6  洗滌浸泡時間過長 按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；

7  偶聯(lián)HRP試劑污染 棄去試劑，重新配置

8  錯誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑 棄去試劑，重新配置

9  TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時間 確定合適的孵育時間：人為判定-高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色；S4-5有淡藍(lán)色；機(jī)器判定620 nm波長下測定OD值達(dá)到0.6-0.65

10  樣本濃度過高或存在基質(zhì)效應(yīng) 建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本稀釋倍數(shù)。

11  濾光片設(shè)置有問題或者波長選擇不對 確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長檢測。

12  酶標(biāo)板不適合做ELISA 不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA高吸附力板子。

背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） 

1  洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留 洗液準(zhǔn)確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

2  底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色 棄去底物，重新配置

3  樣品稀釋液污染 棄去稀釋液，重新配置

4  吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不徹底 吸頭盡可能一次性使用

5  不正確的孵育時間，溫度（尤其是底物孵育的時間） 常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說明書要求。

6  偶聯(lián)抗體（streptavidin-HRP）濃度過高 按照說明書調(diào)整到合適的濃度

7  ELISA板子不正確的貯存 酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃；使用結(jié)合力低點(diǎn)的Elisa板

8  沒有正確封閉 在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間

9  樣本溶血嚴(yán)重 建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會導(dǎo)致背景偏高。

不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1  錯誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品  加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分

2  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤  按照說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

3  標(biāo)準(zhǔn)品污染  使用一次性的滅菌吸頭， 標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃

4  錯誤的倍比稀釋步驟  按照說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

5  波長選擇錯誤 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長。

6  標(biāo)準(zhǔn)品混用  不同批號試劑勿混用

7  試劑盒在運(yùn)輸途中時間太長，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活  盡量縮短運(yùn)輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

8  ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm TMB顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。（數(shù)值仍有梯度規(guī)律）