DNA連接酶主要用于產(chǎn)生新的核酸分子組合，及在將其連接到載體上

這三個(gè)連續(xù)的步驟在連接酶的三個(gè)不同域進(jìn)行，與雙鏈DNA接觸的各個(gè)域環(huán)繞DNA底物形成反應(yīng)域。DNA連接酶主要用于產(chǎn)生新的核酸分子組合，以及在分子克1隆前將其連接到載體上。

用于分子克1隆的DNA連接酶是細(xì)菌來源或者噬菌體編碼。所有真細(xì)菌，無論是嗜熱或嗜溫，包含一個(gè)單一的連接酶基因，編碼NAD*-依賴型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。

在連接反應(yīng)的第yi步中， 使用NAD的二磷酸作為磷酸1酐鍵和腺營基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA連接酶賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)。腺苷酸殘基然后轉(zhuǎn)移到DNA底物的5-磷?；┒?，變得易于受到并列的3'羥基基團(tuán)的親核攻擊。

這導(dǎo)致磷酸二酯鍵的形成，消去AMP,以及形成DNA鏈的共價(jià)連接。用于分子克1隆的DNA連接酶在連接非經(jīng)典底物時(shí)能力有所不同，如平末端雙鏈、DNA-RNA雜交體或單鏈DNA.這些以及其他的屬性歸納于表5。分子克1隆中比較常用的催化體外連接的酶是T4噬菌體編碼的DNA連接酶。

激酶、磷酸酶、磷酸化酶的區(qū)別？

激酶催化磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，比如己糖激酶。

磷酸酶催化磷酸基團(tuán)的水解，與激酶正好相反。

磷酸化酶催化磷酸解反應(yīng)，比如糖原磷酸化酶，催化糖原生成磷酸葡萄糖。這其實(shí)是磷酸解，要是水解就生成葡萄糖了。當(dāng)然一般習(xí)慣上還是說水解。

激酶催化的反應(yīng)一般也叫磷酸化，這沒什么錯(cuò)誤，只是和磷酸化酶容易混淆。

T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之間的連接，連接時(shí)需要5'磷酸基團(tuán)和3'羥基的存在。不僅可以進(jìn)行RNA分子間的連接，也可以進(jìn)行RNA分子(zui短8個(gè)堿基)的環(huán)化連接。

T4 RNA Ligase可以用于RNA和單核苷酸之間的連接，單核苷酸必須為5'和3'均磷酸化的形式，此時(shí)常用于RNA的3'末端標(biāo)記。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之間的連接。當(dāng)DNA提供5'磷酸基團(tuán)，RNA提供3'羥基時(shí)，連接效率較高；當(dāng)DNA提供3'羥基，RNA提供5'磷酸基團(tuán)時(shí)，連接效率非常低。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之間的連接，但連接效率非常低。主要用于DNA的環(huán)化連接，例如5' RACE中的cDNA環(huán)化。DNA和DNA之間的連接盡管可以進(jìn)行，但比較困難。