PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴增的設想：“經DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可合成tRNA基因?！钡捎诋敃r基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克1隆技術的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴增基因的途徑，所以Khorana的設想被人們遺忘了。

1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈式反應”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個循環(huán)后的49 bp長度的第yi個PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請了PCR的專1利，

1987年7月28日批準（專1利號4,683,202 ），Mullis是第yi個發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學術論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。

不對稱PCR(asymmetric PCR）枝術

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR.在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度.常用50~ 100 1比例。在起初的10~ 15個循環(huán)中主要產物還是雙鏈DNA.但當低濃度引物被消耗盡后。高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA.

應用:可制備單鏈DNA部分片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

反轉錄PCR(reverse transcription, RT- PCR技術

當擴增模板為RNA時。需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA才能進行擴增。RT - PCR應用非常廣泛。無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經常采用。

修飾引物PCR技術

為達到某些特殊應用目的.如定向克1隆、定1點突變、體外轉錄及序列分析等?？稍谝锏?*-端加上酶切位點、突變序列、轉錄啟動子及序列分析結合位點等。

污染原因：

1、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴增產物污染：這是PCR反應中主要常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

4、實驗室中質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在內的質粒，由于的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。