T4 RNA Ligase主要用于RNA和RNA之間的連接，連接時(shí)需要5'磷酸基團(tuán)和3'羥基的存在。不僅可以進(jìn)行RNA分子間的連接，也可以進(jìn)行RNA分子(zui短8個(gè)堿基)的環(huán)化連接。

T4 RNA Ligase可以用于RNA和單核苷酸之間的連接，單核苷酸必須為5'和3'均磷酸化的形式，此時(shí)常用于RNA的3'末端標(biāo)記。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和RNA之間的連接。當(dāng)DNA提供5'磷酸基團(tuán)，RNA提供3'羥基時(shí)，連接效率較高；當(dāng)DNA提供3'羥基，RNA提供5'磷酸基團(tuán)時(shí)，連接效率非常低。

T4 RNA Ligase也可以用于DNA和DNA之間的連接，但連接效率非常低。主要用于DNA的環(huán)化連接，例如5' RACE中的cDNA環(huán)化。DNA和DNA之間的連接盡管可以進(jìn)行，但比較困難。

cDNA是指具有與某RNA鏈呈互補(bǔ)堿基序列的DNA。與RNA鏈互補(bǔ)的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當(dāng)引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）作用而合成，并且在合成單鏈cDNA后，再用堿處理除去與其對(duì)應(yīng)的RNA以后，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來(lái)的基因組DNA相同而且無(wú)內(nèi)含子；相反地，對(duì)應(yīng)于在原來(lái)基因中沒(méi)有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，與外顯子序列、先導(dǎo)序列以及后續(xù)序列等一起反映出mRNA結(jié)構(gòu)。
置換合成法。該方法利用鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的DNA RNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物。在大腸DNA聚合酶工的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：①非常有效；②直接利用鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無(wú)須進(jìn)一步處理和純化；③不必使用S1核酸酶來(lái)切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。