熒光分光光度計測試注意事項

①樣品應盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應使用帶塞的熒光池。

②在熒光分析時，為了得到穩(wěn)定且可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機預熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。

③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量的子產(chǎn)率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎無影響。

④當熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。

⑤分子結(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。

⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，拉曼散射與激發(fā)光波長不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān)，因此可以通過選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對散射光的影響進行校正。

⑦熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。

⑧測試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防眼睛造成損傷。

⑨儀器房應注意經(jīng)常通風，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。

熒光分析

熒光分析就是基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強度進行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表征技術(shù)來研究體系的物理、化學性質(zhì)及其變化情況，例如生物大分子構(gòu)象及性質(zhì)的研究。

熒光光譜適用于固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據(jù)樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。

熒光光譜分析可與顯微鏡耦合，獲得微區(qū)分析結(jié)果。熒光是無損傷、非接觸的分析技術(shù)，還可用于自動檢驗、批量篩分、遠程原位分析和分析。

熒光分析的優(yōu)點：（1）靈敏度高；（2）選擇性強；（3）試樣量少、方法簡單；（4）提供較多的物理參數(shù)。但是也存在應用范圍不夠廣泛、對環(huán)境敏感（干擾因素多）等缺點。

熒光光譜定量分析

在低濃度時，溶液的熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。

上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過高時，熒光物質(zhì)濃度過高，其熒光強度反而降低。原因有：

（1）內(nèi)濾效應。一是，當溶液濃度過高時，溶液中雜質(zhì)對入射光的吸收作用增大，相當于降低了激發(fā)光的強度。二是，濃度過高時，入射光被液池前部的熒光物質(zhì)強烈吸收，處于液池中、后部的熒光物質(zhì)，則因受到入射光大大減弱而使熒光強度大大降低；而儀器的探測窗口通常對準液池中部，從而導致檢測到的熒光強度大大降低。

（2）相互作用。較高濃度溶液中，可發(fā)生溶質(zhì)間的相互作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與其基態(tài)分子的二聚物或其他溶質(zhì)分子的復合物，從而導致熒光光譜的改變和/或熒光強度下降。當濃度更大時，甚至會形成熒光物質(zhì)的基態(tài)分子聚集體，導致熒光強度更嚴重下降。

（3）自淬滅。熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與其吸收光譜呈現(xiàn)重疊，便可能發(fā)生所發(fā)射的熒光被部分再吸收的現(xiàn)象，導致熒光強度下降。溶液濃度增大時會促使再吸收現(xiàn)象加劇。

當然，熒光強度的影響因素還有溶劑、溫度、pH值、散射光等，在定量分析中需要加以考慮。

熒光光譜定量分析的計算與其他光譜類似，包括標準曲線法、比例法等。