透射電鏡自噬小體檢測(cè)

胰酶消化，收集作用后的細(xì)胞，離心，先將細(xì)胞塊固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中過(guò)夜。

再用乙醇梯度脫水，接下來(lái)用環(huán)氧樹(shù)脂浸透并切成薄片。隨后超薄切片用銅網(wǎng)固定，后用重金屬醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。通過(guò)TEM分析凋亡細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化，拍照保存。

貼壁細(xì)胞:先倒出培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化或者用細(xì)胞刮(會(huì)產(chǎn)生碎屑)刮下:帶培養(yǎng)液進(jìn)行離心，100-1500/mim 5 10min。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。離心完畢倒出培養(yǎng)液。管底的細(xì)胞團(tuán)不要打散， 沿管壁倒入適量(一般為材料體積的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定約1h-2h. 也可在4C冰箱過(guò)夜。

 細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過(guò)夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過(guò)250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；磁性細(xì)胞標(biāo)記方式應(yīng)用MACS技術(shù)進(jìn)行磁性細(xì)胞分選重要的一點(diǎn)是高質(zhì)量的標(biāo)記。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過(guò)夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學(xué)顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。

電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。

雜交瘤細(xì)胞基因測(cè)序

雜交瘤細(xì)胞有丟失高特異性高活性的風(fēng)險(xiǎn)，或者細(xì)胞狀態(tài)不好乃至。細(xì)胞分化細(xì)胞分化是指同一來(lái)源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過(guò)程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時(shí)間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。而經(jīng)過(guò)雜交瘤測(cè)序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來(lái)穩(wěn)定獲得；從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。同時(shí)還可以使用獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面的申請(qǐng)審批。有時(shí)為了進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)或進(jìn)行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達(dá)的對(duì)應(yīng)的基因序列以進(jìn)一步進(jìn)行生物工程操作與生產(chǎn)。

相較于直接對(duì)進(jìn)行基于蛋白質(zhì)分析的測(cè)序相比，得益于基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測(cè)序可以提供更準(zhǔn)確更可靠的結(jié)果，防止蛋白測(cè)序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險(xiǎn)。