陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

Arf樣蛋白1（Arl1）是GTpases的Ras超家族中的調(diào)控性GTPases Arf家族的成員，并且在整個(gè)真核生物中都具有高度保守的直系同源基因。 Arl1對(duì)果蠅和秀麗隱桿線蟲的早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。 Arl1在主要序列，細(xì)胞定位和功能（膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)）上與Arf1-6較相似，甚至共享幾個(gè)共同的結(jié)合伴侶。 除了其在高爾基體/反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的膜運(yùn)輸功能中，還有報(bào)道表明Arl1在酵母中的離子穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮作用。

Arf6激l活測(cè)定。 經(jīng)GDP（lane1）或GTPγS（lane 2）處理后，純化的Arf6蛋白被免l疫沉淀。 用抗活性Arf6單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫沉淀。

儲(chǔ)存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實(shí)驗(yàn)者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免l疫印跡相關(guān)試劑；

8.  免l疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測(cè)試劑；

分析原理

NewEast Biosciences Arl1激l活檢測(cè)試劑盒基于配置特異性抗Arl1-GTP從細(xì)胞提取物或體外檢測(cè)活性Arl1-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Arl1活化分析。簡(jiǎn)而言之，抗活性Arl1小鼠單克l隆抗l體將用含有Arl1-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。然后，綁定的活動(dòng)Arl1將被下拉蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用抗Arl1兔多克l隆抗l體或抗Arl1小鼠單克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析，檢測(cè)沉淀的活性Arl1。

需要但未提供的材料

1刺激性和非刺激性細(xì)胞裂解物

2蛋白酶抑制素

4°C搖管器或振動(dòng)篩

40.5 M EDTA，pH8.0

51百萬(wàn)氯化鎂

62X還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8免l疫印跡洗滌緩沖液，如TBST（10 mM Tris HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05%

吐溫-20）

9免l疫印跡阻斷緩沖液（含5%脫脂奶粉或3%牛血l清白蛋白的TBST）

10PVDF或硝化纖維膜

11次級(jí)抗l體

12ECL檢測(cè)試劑