pcr擴(kuò)增的基本原理

基本原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然copy過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。DNA的半保留復(fù)1制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則copy成同樣的兩分子拷貝。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)1制。

PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則

引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

引物堿基：G C含量以40-60%為宜，G C太少擴(kuò)增效果不佳，G C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC建議隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列參照。

引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，

引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，zui佳選擇是G和C。

引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地1高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR術(shù)

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA的部分片段，大小取決于.上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。