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Tris試劑桶裝,在病毒保存液中,加入Tris首先可以維持采樣樣本的pH值,起到生物緩沖劑的效果,病毒及其核酸對(duì)環(huán)境pH是比較敏感的,核酸(DNA、RNA)在酸性溶液中易水解,在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。而Tris三羥,PH緩沖范圍:7.0-9.0,能夠維持待提取樣品裂解后釋放的核酸的穩(wěn)定性,以避免核酸的降解,提高核酸的濃度和純度,有利于提高核酸的質(zhì)量,保證后續(xù)核酸檢測(cè)分析等操作的準(zhǔn)確性。
Tris-HCl緩沖液的缺點(diǎn):1、緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大,緩沖液稀釋十倍,pH值的變化大于0.1;2、溫度效應(yīng)大,溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大,即:△pKa/℃=-0.031 ,例如:4℃時(shí)緩沖液的pH=8.4,則37℃時(shí)的pH=7.4,所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制,室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃~4℃。3、易吸收空氣中的CO2,所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。
一旦確定了緩沖液的pH值,就需要選擇使用什么樣的緩沖體系。首先是在選擇緩沖體系時(shí)要確保選擇的緩沖體系在你設(shè)定的pH值上確實(shí)具有緩沖能力。選擇的緩沖體系,其解離常數(shù)pKa值應(yīng)該在設(shè)定的pH上下一個(gè)pH值單位內(nèi)。
再者是確保你使用的緩沖液濃度足夠高以達(dá)到實(shí)際緩沖溶液的作用,正常一般選擇的濃度是20~100mM。需要記住的是你所使用的緩沖體系不應(yīng)該影響蛋白活性!例如,磷酸鹽會(huì)抑制激酶的活性,所以反應(yīng)前應(yīng)徹底地透析掉。
此外,一些緩沖體系對(duì)溫度非常敏感,例如Tris-HCl緩沖液,如果你在25℃時(shí)將緩沖體系調(diào)至pH值8,pH值將在5℃時(shí)增加到8.58而在37℃時(shí)降到7.71。所以,如果打算在4℃條件下保存蛋白或在37℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn),就應(yīng)該考慮到室溫下調(diào)的pH值可能在實(shí)驗(yàn)條件中就不適用了。 其他類型的色譜分離柱,如凝膠過(guò)濾柱和Ni2 親和層析柱,可能需要更高的鹽濃度。我一般用高達(dá)500 mM NaCl進(jìn)行高鹽淋洗,以防止蛋白和柱之間的非特異性結(jié)合。