介質(zhì)孔徑大小及孔隙率對(duì)生物分離的影響

除了粒徑大小和分布會(huì)影響層析介質(zhì)分離性能外，孔徑大小、比表面積及孔隙率也是生物分離純化介質(zhì)參數(shù)之一。層析分離模式主要是分子與介質(zhì)表面功能基團(tuán)作用的結(jié)果，層析介質(zhì)可及比表面積是影響其吸附載量的主要因素，可及比表面積是分子可到達(dá)的內(nèi)孔表面積加上介質(zhì)外表面積。由于內(nèi)孔表面積占據(jù)整個(gè)比表面積的90%以上，而內(nèi)孔表面積主要由孔徑大小，孔隙率來決定。孔徑越小比表面積越大，但如果孔徑太小，目標(biāo)生物分子進(jìn)不去，這樣的小孔及其表面積對(duì)分離是沒有作用的。孔徑太大，比表面積也會(huì)降低，因此對(duì)于不同分子量大小的生物分子，有個(gè)的孔徑大小，其可及表面積，分離。比如用于抗l生素這類分子量小的生物分子，孔徑一般選擇小于30納米以下，而對(duì)于抗l體蛋白分離純化的介質(zhì)一般選擇孔徑在100納米左右，而對(duì)于病毒這種大尺寸的生物體，需要400納米以上超大孔的介質(zhì)。超大孔徑介質(zhì)制備技術(shù)難度極大，這也是為什么目前沒有好的層析介質(zhì)可以有效分離病毒的原因之一。

以純化溶瘤病毒為例，由于其在生產(chǎn)過程中存在宿主蛋白等雜質(zhì)，純化前 SEC測(cè)試純度為6.5%。純化采用兩種基質(zhì)相同的介質(zhì)，其表面化學(xué)功能也很一致，主要區(qū)別是前者是無孔實(shí)心的層析介質(zhì)，而后者是傳統(tǒng)的多孔層析介質(zhì)。層析純化的方法是陰離子交換吸附然后梯度洗脫（Bind-elute）模式。從層析圖譜可以看出，在洗脫及CIP過程中無孔介質(zhì)洗脫雜質(zhì)更小，峰值更低，意味著上樣過程中結(jié)合的雜質(zhì)會(huì)更少，有利于表面結(jié)合的病毒分子純化。通過對(duì)層析洗脫液SEC純度分析比較，發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)的多孔層析介質(zhì)實(shí)驗(yàn)得到的病毒樣品純度為54%（圖 ），而用無孔的同類型介質(zhì)實(shí)驗(yàn)得到的病毒純度達(dá)到接近90%（圖 ）。

抗l體藥l物的生產(chǎn)工藝進(jìn)展  

  抗l體藥l物生產(chǎn)是個(gè)非常復(fù)雜的過程，大致分為上游的發(fā)酵及下游的分離純化：上游工藝主要包括細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、發(fā)酵生產(chǎn)。而下游工藝主要包括膜過濾及多步層析分離純化。過去十多年來，基因工程獲得突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，細(xì)胞培養(yǎng)的表達(dá)量從原來的不到0.5 g/L 到現(xiàn)在普遍達(dá)到5g/L，有的甚至超過10g/L。這些進(jìn)步是由細(xì)胞表達(dá)載體的開發(fā)，克l隆篩選以及細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化等技術(shù)所驅(qū)動(dòng)的。由于發(fā)酵產(chǎn)率的大幅度提升，使得上游細(xì)胞培養(yǎng)成本大幅度降低（表1）。

表面親水化改性微球替代親水性微球    用于抗l體或蛋白純化分離的層析介質(zhì)必須具有很好的表面親水性，因此市場(chǎng)上主要的Protein A 產(chǎn)品要么是基于親水多糖類材料，或者是用親水單體做的基球，這種基球雖然親水性能好，非特異性吸附低但機(jī)械強(qiáng)度差。為了保持基球的機(jī)械強(qiáng)度并解決介質(zhì)親水性問題，納微采用先合成高機(jī)械強(qiáng)度高交聯(lián)的聚丙l烯酸酯微球，然后通過多步表面親水化改性，再進(jìn)行Protein A配件偶聯(lián)。這種方法雖然工藝復(fù)雜，但生產(chǎn)的介質(zhì)既有高機(jī)械強(qiáng)度，又有表面親水性能好，非特異性吸附低等特性。因此UniMab在抗l體分離過程中，HCP去除效果好, 可以達(dá)到軟膠Protein A 的同等水平。