DNA測(cè)序檢測(cè)

1. PCR測(cè)序反應(yīng)

(1)取0.2ml的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:

所加試劑測(cè)定模板管標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管

BigDye Mix

1μl

待測(cè)的質(zhì)粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )雙鏈DNA

-1μ1

待測(cè)DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

滅菌去離子水

2μ 1

總反應(yīng)體積5μ 1,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀.上進(jìn)行擴(kuò)增。98C變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，

PCR循環(huán)參數(shù)為96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4C保溫。

2.乙醇法純化PCR產(chǎn)物

(1) 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C離心30 min,小心棄上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4C離心5min,小心棄上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理。

(1)加入12μ 1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

(2)將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

(3)在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95C 2min),冰中驟冷，待_上機(jī)。

4..上機(jī)操作按儀器操作說(shuō)明書(shū)安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立

運(yùn)行的測(cè)序順序文件。

5.儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過(guò)

序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。

6.測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法,是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動(dòng)態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強(qiáng)的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測(cè)定基因組整體水平DNA甲l基化水平。5、滴度檢測(cè):細(xì)胞為30%－50％時(shí)加入病毒上清液，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。該方法由Ruo等1980年首l次報(bào)道。過(guò)程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測(cè)DNA甲l基化水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.高l效毛細(xì)管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細(xì)管來(lái)從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場(chǎng)下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開(kāi)。數(shù)據(jù)分析：提供lncRNA和mRNA表達(dá)譜差異分析和功能分析，以及二者的關(guān)聯(lián)分析。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來(lái)確定5mC水平，簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)且敏感性高。

RNA提取預(yù)備工作

RNA酶（Rnase）是導(dǎo)致RNA降解主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些的條件下只可暫時(shí)失活，但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時(shí)必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無(wú)菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)，通常不必再處理。

18.引物是經(jīng)過(guò)PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說(shuō)不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。lncRNA和mRNA同時(shí)檢測(cè)：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列檢測(cè)探針。國(guó)內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問(wèn)題可能就會(huì)少一些。

19. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。

◆長(zhǎng)度一般為18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的熒光染料參數(shù)