傳統(tǒng)小分子特異性antibody制備技術(shù)

為解決小分子這類半抗原物質(zhì)無法刺激宿主動物產(chǎn)生antibody的特性，必須將半抗原回復完全抗原的特性。解決這個問題可以通過將小分子和對宿主動物immune原性很強的物質(zhì)：如OVA、BSA、KLH等偶聯(lián)，將其制備成完全抗原，通過immune宿主動物，便能促使宿主動物產(chǎn)生針對小分子的特異性antibody，這類antibody通過抗原特異性的篩選便能獲取目的antibody。目前，通過此項技術(shù)能解決絕大多數(shù)小分子特異性antibody的制備，但是也可能由于小分子的結(jié)構(gòu)特異，偶聯(lián)物和偶聯(lián)方式的選取、偶聯(lián)率的差異以及immune技術(shù)有待發(fā)展等多方面的因素使其特異性antibody的制備存在困難。

選擇素elisa試劑盒的實驗原理

選擇素elisa試劑盒是一類異親型結(jié)合、Ca2 依賴的細胞粘著分子，能與特異糖基識別并結(jié)合。主要參與白細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的識別與粘著。

實驗原理：

將目標包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入品或標本，其中的目標連接于固相載體上的結(jié)合，然后加入微生物化的目標，將未結(jié)合的生物素洗凈后，加入HRP標記和親和素，再次洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的目標呈正相關(guān)。用酶1標儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計算樣品濃度。

精密度：精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。CV（%）=SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次選擇素elisa試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測，每份樣本連續(xù)測定20次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復測定8次，分別計算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差： CV<10% Inter-批間差： CV<13%

經(jīng)測定，試劑盒在X期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性率小于5%。為減小外部因素對試劑盒前后檢測值的影響，實驗室的條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可人為誤差。

選擇素elisa試劑盒識別的配體都是一些寡糖基團，迄今為止發(fā)現(xiàn)的配體都是一些具有唾液酸化路易斯寡糖(s-Le，siaglyl-Lewis)或類似結(jié)構(gòu)的分子。一種寡糖基團可以存在多種糖蛋白和糖脂分子上，并分布于多種細胞表面，因此選擇素分子配體在體內(nèi)分布較為廣泛。

提取DNA常用的方法

　　一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

　　二.甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

　　三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。

　　四.異丙1醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙1醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在異丙1醇中可溶狀態(tài))

　　五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

　　六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。

　　七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。