如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進(jìn)樣量、樣品的濃度、切割點(diǎn)的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動(dòng)相盡量等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算準(zhǔn)確，檢測器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到很小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，盡量是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？

（1）了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等,以達(dá)到較好的溶解度。

（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑以助溶。

（3）不是一定要用流動(dòng)相來溶解樣品，對(duì)溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對(duì)一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會(huì)造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會(huì)影響峰型。

（4）可以固體上樣。

備型柱子柱壓上升，柱效下降，怎么辦？

對(duì)高的價(jià)值的制備柱來講，延長柱子壽命是很重要的。一般要注意保護(hù)柱子，一般來說，制備柱子一般需要保護(hù)柱配套。

下面是可能堵塞柱子的原因：

（1）如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒有經(jīng)過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會(huì)積聚在柱頭造成柱壓升高。

（2）也有可能是因?yàn)槟褂玫牧鲃?dòng)向中含有緩沖鹽的原因，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞?？梢园阎記_一沖。

（3）流動(dòng)相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理？

制備色譜的填充

填料是工業(yè)制備色譜的血脈，填料的選擇和利用是非常關(guān)鍵的，目前已有越來越多的產(chǎn)品應(yīng)用到IPC中。填料的化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)決定了色譜的分離性能和動(dòng)力學(xué)性能。應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化制備色譜中的填料具有如下特殊的要求?！　?

1、機(jī)械強(qiáng)度高：填料需要承受很大的機(jī)械壓力，因?yàn)樘盍显贗PC使用中，需要經(jīng)常裝卸，機(jī)械性能差的填料經(jīng)受不住反復(fù)填充，它們易破碎，產(chǎn)生細(xì)顆粒，降低柱滲透性，甚至堵塞濾片，造成流速分布不均勻，影響分離產(chǎn)物的純度，在系統(tǒng)中產(chǎn)生極高的柱壓而無法繼續(xù)使用引?！　?

2、負(fù)載量大：在IPC中，填料的負(fù)載量越大，則單位體質(zhì)量填料可處理的原料量就可增加，因而提高了產(chǎn)率。選擇合適孔徑及孔徑分布的填料是獲得高負(fù)載量的一個(gè)關(guān)鍵因素。　　

3、可大量供應(yīng)，批間的重現(xiàn)性好：制備色譜工藝過程要擴(kuò)大，必須有可靠的供貨源提供大量填料，否則無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。填料各批量之間的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性、孔結(jié)構(gòu)及可重復(fù)的比表面積等必須具有高度的重現(xiàn)性，否則難以保證長期、持續(xù)、穩(wěn)定的分離與純化生產(chǎn)工藝?！　?

4、合適的顆粒大小和窄的粒度分布范圍：細(xì)顆?？稍黾铀鍞?shù)及分辨率，但同時(shí)引起裝柱困難，需要更高的操作壓力。