如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進(jìn)樣量、樣品的濃度、切割點(diǎn)的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動(dòng)相盡量等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算準(zhǔn)確，檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到很小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒(méi)有過(guò)載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，盡量是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

反相色譜分離后，如何快速?gòu)牧鲃?dòng)相中得到產(chǎn)品？

可以考慮先在低溫下，減壓旋蒸除去其中的有機(jī)的溶劑，然后用萃取的方法把產(chǎn)品萃取出來(lái)，然后再低溫再旋蒸，這樣，就可以不將溫度升得很高而得到產(chǎn)品。如果要直接蒸掉流動(dòng)相，水泵的真空度要注意（要檢查氣密性），否則蒸水會(huì)很慢。一般比較好的泵在60～70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80～90度才行，這樣容易暴沸導(dǎo)致樣品損失。溫度太高可能引起物質(zhì)變性。

制備色譜之DAC如何次次裝出高柱效

動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱（Dynamic Axial Compression Column，DAC）是工業(yè)化制備液相色譜分離的重要組成部分。當(dāng)用戶填裝直徑50mm以上制備柱時(shí)，傳統(tǒng)預(yù)裝柱很難裝出高柱效和對(duì)稱(chēng)性，另外預(yù)裝柱使用過(guò)程柱頭容易塌陷，導(dǎo)致柱效變差，無(wú)法滿足長(zhǎng)期持續(xù)純化生產(chǎn)。DAC在運(yùn)行過(guò)程中，活塞可以提供持續(xù)壓力，保證很優(yōu)的填裝柱床密度和穩(wěn)定性，從而長(zhǎng)時(shí)間保持很佳分離效果。相比于預(yù)裝柱或彈簧柱，DAC可以輕松填裝和拆卸，實(shí)現(xiàn)不同填料反復(fù)填裝和輕松切換。有人說(shuō)大柱子不用考慮柱效和對(duì)稱(chēng)性，只要能分出樣品就行?，F(xiàn)實(shí)是色譜就是靠柱效來(lái)分離的，柱效越高，分離越好，載量越大，收率和得率越高。

通常制備色譜方法開(kāi)發(fā)在4.6mm，10mm或20mm的半制備柱，然后放大到DAC50或DAC100, DAC200，DAC300, DAC450, DAC600或DAC800。理論上多大規(guī)模的色譜柱都可以實(shí)現(xiàn)與分析柱或半制備柱同樣的效率，在現(xiàn)實(shí)中，設(shè)計(jì)優(yōu)良的DAC柱效甚至高于預(yù)裝柱。只有柱效和對(duì)稱(chēng)性類(lèi)似才能保證了分離方法的線性放大。